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實(shí)時(shí)熒光定量PCR服務(wù)在實(shí)際應(yīng)用中的定量分析法

發(fā)布日期： 2020-01-10
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 　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物的總量，通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定基因序列進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR服務(wù)包括SYBRGreen熒光定量和TaqMan探針PCR，提供檢驗(yàn)設(shè)計(jì),RNA提取、標(biāo)準(zhǔn)品制備,數(shù)據(jù)分析和詳盡的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。  
　　1. Ct值的定義 
　　在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。  
　　2. 熒光域值（threshold）的設(shè)定 
　　PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15  
　　3. Ct值與起始模板的關(guān)系 
　　研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。