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蛋白共提取試劑盒對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法
發(fā)布日期:
2018-05-21
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蛋白共提取試劑盒是從培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物組織樣品同時(shí)抽提RNA和DNAzui為快速簡(jiǎn)單的方法。本試劑盒基于硅膠柱純化技術(shù),提取過程中無需使用有毒的酚氯仿抽提,也無需進(jìn)行耗時(shí)的醇類沉淀,整個(gè)過程只需35分鐘。該方法得到的RNA可直接用于RT-PCR, Northern blot, poly-A 純化,核酸保護(hù)和體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。
1.根據(jù)用量取適當(dāng)?shù)臐{蛋白抽提試劑和核蛋白抽提試劑加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM。PMSF需現(xiàn)用現(xiàn)加,若目標(biāo)蛋白含有豐富的半胱氨酸,可以在兩種蛋白抽提液中加入DTT至終濃度0.5mM。
2.對(duì)于貼壁細(xì)胞,去除培養(yǎng)液,用PBS洗一遍,用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞,或用EDTA消化后吹打下細(xì)胞(不用胰酶硝化,以免胰酶消化目的蛋白)。500g離心2~3分鐘收集細(xì)胞,吸盡上清留下沉淀備用。
3.對(duì)于懸浮細(xì)胞:用PBS洗一遍,500g離心2~3分鐘收集細(xì)胞,吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。
4.每20ul細(xì)胞沉淀加入200ul漿蛋白抽提試劑(2×106個(gè)細(xì)胞沉淀約20ul或40mg)。
5.用移液器吹打或高速渦旋15秒(可適當(dāng)延長),必須使細(xì)胞沉淀*分散開成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞沉淀分散不*會(huì)導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量降低。
6.冰浴10分鐘。
7.zui高轉(zhuǎn)速劇烈渦旋10秒,4℃12000~16000g離心10分鐘。
8.上清即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白,立即吸取上清至預(yù)冷的樣品管中備用,進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western等實(shí)驗(yàn),但蛋白濃度較低,可根據(jù)需要進(jìn)行相應(yīng)濃縮。
9.沉淀即為細(xì)胞核,要*吸盡殘余的上清(避免細(xì)胞漿蛋白的污染),加入50-100ul核蛋白抽提試劑。
10.用移液器吹打或高速渦旋15秒(可適當(dāng)延長)至沉淀*分散,冰浴10分鐘。
11.zui高轉(zhuǎn)速劇烈渦旋10秒,4℃12000~16000g離心10分鐘。
12.立即吸取上清至預(yù)冷的樣品管中,此即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白??蛇M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-70℃凍存。